Nel 1526 le armate Lanzichenecche di Carlo V scendono in Italia per minacciare lo Stato Pontificio. Giovanni dalle Bande Nere, con continue incursioni contro l’esercito nemico, tenta di contrastarne l’avanzata. Tradito dal Duca di Ferrara, Alfonso d’Este, viene gravemente ferito in battaglia, e muore a Mantova il 30 novembre del 1526, a soli 28 anni. Nel 1527 i lanzichenecchi saccheggeranno senza pietà la città di Roma. La strenua e sfortunata resistenza di Giovanni dalle Bande Nere nei confronti degli Alemanni sono al centro de "Il mestiere delle armi", film del 2001 di Ermanno Olmi premiato con nove David di Donatello.